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    m6A单碱基位点qPCR（MazF酶切法）

    • 简介
    • 服务特点
    • 样本要求
    • 结果展示

    • 当前的研究发现，很大一部分m6A修饰发生在含有核心ACA序列的保守motif区域，通常称为是m6ACA位点。康成生物丨数谱生物给予对RNA上潜在m6ACA位点进行检测或验证的技术服务——m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）。


      RNA内切酶MazF识别RNA单链并在非甲基化的ACA位点的5’端进行切割，而不能切割甲基化的m6ACA位点(图1)。

        

      图 1. MazF可以在非甲基化ACA位点切割，而无法在甲基化m6ACA位点发挥作用


      将抽提的总RNA样本分为两份，一份不加MazF处理，另一份加MazF处理后。然后顺利获得实时定量PCR技术进行检测（图2）。最后，经过数据分析处理得到检测的样品中特定ACA位点的m6A甲基化水平。

        

      图2. m6ACA位点PCR检测（MazF酶切法）实验原理


      mRNA&lncRNA m6ACA位点检测：RNA m6ACA位点预测→total RNA提取&质检→一份MazF酶处理，一份不加MazF酶处理→反转录成cDNA→目标m6ACA位点PCR检测

      CircRNA m6ACA位点检测：RNA m6ACA位点预测→total RNA提取&质检→RNase R消化线性RNA，保留circRNA→ 一份MazF酶处理，一份不加MazF酶处理→反转录成cDNA→目标m6ACA位点PCR检测

    • ●对m6A单位点的相对定量检测
      ●对m6A位点高度敏感的核糖核酸内切酶MazF
      ●顺利获得严格测试的特异性引物

    • 样本类型：新鲜组织、细胞或total RNA
      样 本 量：
           mRNA&lncRNA m6ACA位点检测：：≥2μg total RNA或者能取得相应份量的组织细胞，最低浓度不低于50ng/μl。
           CircRNA m6ACA位点检测：≥10μg total RNA或者能取得相应份量的组织细胞，最低浓度不低于50ng/μl。
      样品质量：A260/A280为1.9~2.2；无基因组DNA污染；RNA无降解。
      样本运输：RNA样品使用RNAase-Free离心管保存，封口膜封口后干冰运输；组织细胞样品RNAase-Free冻存管保存，干冰或液氮运输。

    • m6ACA位点PCR（MazF酶切法）可对单个m6ACA修饰位点进行检测（以下为示例展示）。


       

      sample

      MazF-(Ct)

      MazF+ (Ct)

      Methylation ratio %

      1

      22.970

      23.354

      76.611

      2

      22.968

      23.854

      54.101

      3

      22.980

      24.774

      28.856

      4

      23.033

      27.340

      5.051

      5

      23.006

      28.308

      2.535

      6

      23.008

      30.821

      0.452